2010-2-4 16:36 plantextra
高效液相色谱常见问题分析与对策

高效液相色谱常见问题分析与对策cjj&_v/a!W;R:G
液相色谱系统的许多问题都能在谱图上反映出来。其中有一些问题可以通过改变设备参数得到解决;而其他的问题必须通过修改操作程序来解决。对于色谱柱和流动相的正确选择是得到好的色谱图的关键。
B*D6p c$[ [
3jc,ej)p+E#t_~ +_3pM4R LX5|Am
a、峰拖尾~k_#Y)DX.n"E5e@
原因及解决方法*u [T.Y`Q ^N
1、筛板阻塞 2h;`slR*V&l
a、反冲色谱柱  b、更换进口筛板 c、更换色谱柱|!x1|aY g
QU5F$IZeC&E
2、色谱柱塌陷
#k;m"Z5n)Y1k 重新填充色谱柱
YCn!kb@
Snf.E-M'ub.@c 3、干扰峰
x+rF9T e/U~ a、使用更长的色谱柱 b、改变流动相或更换色谱柱AN i0Re5zk eq

-Y;qK#SW'I 4、流动相PH选择错误 *pZ+| M]}f%T8t
调整PH值。对于碱性化合物,低PH值更有利于得到对称峰。Z6g@K rB+G
8J4| e+{a bkhp
5、样品与填料表面的溶化点发生反应 L!yj'n C$w8d
a、加入离子对试剂或碱性挥发性修饰剂  b、更改色谱柱\ _,GauEi
4iJZ'|2} h'\3cV
b、峰前延j[ eIK?x
原因及解决方法
|\p,Y:P4e7X.A
5Zk!Y&z"S.x*C 1、柱温低
2yul#AoC9o 升高柱温fA|#v?j
!P"O$Il/ME t
2、样品溶剂选择不恰当 I#^%M*U6SBi1s
使用流动相作为样品溶剂^,uvyL^

ys:Wy V 3、样品过载
^E*b:l w^)^8~{L9m1R 降低样品含量,F?{8l Aa4GI$i7f3U
8rZ9t7w8g+S3j{l5B
4、色谱柱损坏
^/? Nhn 见a1、a2
z*q nRK 5y$DF(Q7|"bl
c、峰分叉
A2gA#d5T`3` 原因及解决方法
+@6x)d+t5x B d"a H w^!A2V4wtb#yUzo@
1、保护柱或分析柱污染
-H(g3MoGu ^ cH 取下保护柱再进行分析。如果必要更换保护柱。如果分析柱阻塞,拆下来清洗。如果问题仍然存在,可能是柱子被强保留物质污染,运用适当的再生措施。如果问题仍然存在,入口可能被阻塞,更换筛板或更换色谱柱。5n4I w%ZOc2z
n4_ Y z7[A!A6L
2、样品溶剂不溶于流动相 C*{*p+F,r&Iu
改变样品溶剂。如果可能采取流动相作为样品溶剂。
R&Hu@'M3A {[[-sg
d、峰变形
+~t0u-[^ ^1Vgw@0V 原因及解决方法
#R8| E]7o
+W'H$W.T*~d-a5]'A2x;s 1、样品过载
b {;rT|){v3P0w 减少样品载量
1a^#|zu;Y a`7q?/yv${
e、早出的峰变形?hp5`;\6]mK
原因及解决方法7q4XxU6n-c
t0}TA8re
1、样品溶剂选择不恰当 SahZ!sWnD
a、减少进样体积   b、运用低极性样品溶剂
&T&t#hIj}eF.g
!Yt wV)~s5k f、早出的峰拖尾程度大于晚出的峰
m-[*a$HU/fx~ 原因及解决方法
*b2?Msn :j0H'R(ydkKz2q
1、柱外效应
A-s#@1k:XZ a、调整系统连接(使用更短、内径更小的管路) b、使用小体积的流通池,E5x8D6t kO

3K!G:o*S;g2@Y-\ g、K’增加时,脱尾更严重
"sd-e'X+R jQ C&aD 原因及解决方法sLP-y)Rf
T9Y,Er;FK5zN
1、二级保留效应,反相模式}'SsG4E
a、加入三乙胺(或碱性样品) b、加入乙酸(或酸性样品) c、加入盐或缓冲剂(或离子化样品) d、更换一支柱子 0h(j$PP1Shf+@mh

&_ ~2RY g y%Fqv.| 2、二级保留效应,正相模式!jym:GI a0z
a、加入三乙胺(或碱性样品) b、加入乙酸(或酸性样品) c、加入水(或多官能团化合物) d、试用另一种方法s3?4K,fMw
6m6G2oN$n+{H
3、二级保留效应,离子对 )xnH,c;Q/a$b
加入三乙胺(或碱性样品)
^9w G+|*X,`&s 5PDAt8w
h、酸性或碱性化合物的峰拖尾
d"Gc'\C 原及因解决方法$^Q7cp(YnV+]
^} `!zzR
1、缓冲不合适 *TLc2Y6}(n\
a、使用浓度50-100mM的缓冲液 b、使用Pka等于流动相PH值的缓冲液
B9{x$u'D dH q
2u3rf#w4I+c1U-p i、额外的峰
XCP-EC j@R 原及因解决方法
[/Dl~$Z2J ;N G.`Ehj'E^
1、样品中有其他组份 _;\U}6\/Y
正常5A W3TiriM+N

g6g)}F~ 2、前一次进样的洗脱峰
7S!TXeAE(g a、增加运行时间或梯度斜率 b、提高流速U o9k{&Nk

H/w+b D6j 3、空位或鬼峰
Y;h5C(]7|E%V1c7z a、检查流动相是否纯净 b、使用流动相作为样品溶剂 c、减少进样体积
3n*Y!^tE,x cl4mczvPy
j、保留时间波动.O8e p@,e:Eo_\PM;S`
原及因解决方法a,q v[N&i:me

3@!]Cx!HUxE 1、温控不当y&Q8tBN)LX4C2d
调好柱温
5tT+yV&s!Mr#`V 0xrjHKQ:raX
2、流动相组分变化`b-A3Z2Y F
防止变化(蒸发、反应等)`[[.SXl/z.w6]o
9{^vyqG
3、色谱柱没有平衡
1xbyODn 在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱
|J'D.S,a NH .{!JI)k,[1c2G\K _
k、保留时间不断变化
[,yhw{0?%e 原及因解决方法t+z8L Fq0}

\C1xr1Ho? a:Jf 1、流速变化
.y`R)I+AQ 重新设定流速M0R4~N Z#~^

DS'wJ'z(r,\E 2、泵中有气泡
Ba2I2UG{.b S?&DA 从泵中除去气泡0ZAm*N;KGvm1Va za
A,M a^;a+VB_
3、流动相选择不恰当 d8o,B8q ^-O\
a、更换合适的流动相 b、选择合适的混合流动相
m9_vo-E ;H Xam Vs$CZb`
l、基线漂移
%~#HN^3k C+LW 原及因解决方法a7zKk1R QY%zxE%U
T f#GR,Zm!|/q
1、柱温波动。(即使是很小的温度变化都会引起基线的波动。通常影响示差检测器、电导检测器、较低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器。) )D kzd g{
1、控制好柱子和流动相的温度,在检测器之前使用热交换器图6JP!Q JqC*e

,X9Gz7{7C3] 2、流动相不均匀。(流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移。) /AM]VQ6nTg
使用HPLC级的溶剂,高纯度的盐和添加剂。流动相在使用前进行脱气,使用中使用氦气。%Sn,PRdU!x)F!~&v%X
J[ UGbD^
3、流通池被污染或有气体J&w0o2N o!T]
用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池。如有需要,可以用1N的硝酸。(不要用盐酸)
5|+v)rgz7D9w(V}dJ
w!hv$Zp6f.u] 4、检测器出口阻塞。(高压造成流通池窗口破裂,产生噪音基线)
7x5];t&s L:w 取出阻塞物或更换管子。参考检测器手册更换流通池窗。
/m\z;cR1e-O #@,AVY1q
5、流动相配比不当或流速变化 k `+t~~+h5Ro u
更改配比或流速。为避免这个问题可定期检查流动相组成及流速。9G)g0ailU*x

E*PZv&z)ZHt 6、柱平衡慢,特别是流动相发生变化时
T9M)Z\i G,aRi[g 用中等强度的溶剂进行冲洗,更改流动相时,在分析前用10-20倍体积的新流动相对柱子进行冲洗。
'il:?;EU(} fx Fq
gbnjt*w5R 7、流动相污染、变质或由低品质溶剂配成
-@.C[jxeS Q 检查流动相的组成。使用高品质的化学试剂及HPLC级的溶剂G B8^;c"j9k$z\ @
NI"xT|0~@s0]B,Q
8、样品中有强保留的物质(高K’值)以馒头峰样被洗脱出,从而表现出一个逐步升高的基线。 %l!yIk.GQn j
使用保护柱,如有必要,在进样之间或在分析过程中,定期用强溶剂冲洗柱子。iW9lv:f6FS k
e7tTp0phK
9、使用循环溶剂,但检测器未调整。
v_2^:r2tDP 重新设定基线。当检测器动力学范围发生变化时,使用新的流动相。
X8m`2W.c
Ok{t-D3Jt M 10、检测器没有设定在最大吸收波长处。 O7a)N f/G,ri3y[C
将波长调整至最大吸收波长处
sEt-THa @e ft"{
m、基线噪音(规则的)^ R@:W7^
原及因解决方法
&SR4Klo4K#o
"jyEGOUWn 1、在流动相、检测器或泵中有空气 n3o:yk6h)g
流动相脱气。冲洗系统以除去检测器或泵中的空气。6k-Wl_V;L(c4X vN
jck5O0M
2、漏液 {}m&]9T%P3e
见第三部分。检查管路接头是否松动,泵是否漏液,是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要,更换泵密封。:J*o Aw]J
dUy6VuWl
3、流动相混合不完全 A-P&ZY2P o _
用手摇动使混合均匀或使用低粘度的溶剂
D$x@)_2}d/K:[
$o.~ gdz%Eut T 4、温度影响(柱温过高,检测器未加热)
kk#OU6i.b-zB 减少差异或加上热交换器
.TMUQ:^9R7O/I 2K \_U-l[8Z9B
5、在同一条线上有其他电子设备
M_ n;f @/]4p^i 断开LC、检测器和记录仪,检查干扰是否来自于外部,加以更正。
jnp/I3IE
TyZO8z 6、泵振动1o7Y$e5k4gp
在系统中加入脉冲阻尼器
$n-_}"@ Nl AKa]%k"K
n、基线噪音(不规则的)(rn+|AD&e^s9D
原及因解决方法
t"BU$a&r
2j u za.ZO9pC 1、漏液
1e;n _q Y)oK)\ | 见第三部分。检查接头是否松动,泵是否漏液,是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要,更换密封。检查流通池是否漏液。
5W]jO huY .xnld#K4G*B
2、流动相污染、变质或由低质溶剂配成
c,sjz ?4U| 检查流动相的组成。9D;X AWl#Xo2T3_!i
d:iS/x:HJVc*fw~
3、流动相各溶剂不相溶 z7y$[Q Eh[ C&f[
选择互溶的流动相X@bOE)IR6API

1Waf o@2QR{ 4、检测器/记录仪电子元件的问题
"D9{;}x2r 断开检测器和记录仪的电源,检查并更正。~6S*V zMK,[@

*E CU |xH,}_ 5、系统内有气泡 %Q8k;?:cC0w~
用强极性溶液清洗系统
V1Fe9}:E ;e[E3K5MpJ!q d
6、检测器内有气泡
|O1vP} V6o+_!l#Y 清洗检测器,在检测器后面安装背景压力调节器
5p5xK5cE9j$l cR:hn1jwdA ]%I
7、流通池污染(即使是极少的污染物也会产生噪音。)@:t/j)v"_2I
用1N的硝酸(不能用磷酸)清洗流通池
vb;v V$g!w Q5k'tym H2W
8、检测器灯能量不足
E U0S0M[ P/nao 更换灯9N)Jh0uwibq

c,\5HVi 9、色谱柱填料流失或阻塞
K;JZ y:K r,P%\z$rY 更换色谱柱
}btP5H,q-^0YWf
+Q+r7xPn:y6E-h9mQ 10、流动相混合不均匀或混合器工作不正常
joH&D^:@0` D 维修或更换混合器,在流动相不走梯度时,建议不使用泵的混合装置
6['Em$pm"qPN C,D&Vr(T4D'q
o、宽峰3E/}&Uy*GWq
原及因解决方法
~j*}2va(f+x4m Q &lI%aJh~M
1、流动相组成变化
Q8VBI0i P z,t)D 重新制备新的流动相
I9IB&l o`B8U 4y;jX!R x
2、流动相流速太低x!h9}Qk3y
调节流速
PGm/IIa ^
1RO1B-fm4d6x` 3、漏液(特别是在柱子和检测器之间)
_,qD3GN 见section 3。检查接头是否松动、泵是否漏液、是否有盐析出以及不正常的噪音。如果必要更换密封。@*o{ Jg[
3Ci x:m1^ Y]
4、检测器设定不正确 !DC+j[@/h)V9r
调整设定(A3QT ]#NSX

+xB&YeTF 5、柱外效应影响8M)TmOANi5GG:V
a、柱子过载 b、检测器对反应时间或池体积响应过大  c、柱子与检测器之间的管路太长或管路内径太大  d、记录仪响应时间太长
@5c(e1?#lDV blgA"n 解决方法: a、 小体积进样(例如:10ul而不是100ul)以1:10或1:100的比例稀释样品  b、减少响应时间或使用更小的流通池  c、使用内径为0.007-0.01的短管路  d、减少响应时间C+W o7a'n
t}wh$@4Rh,N
6、缓冲液浓度太低
u8ab2fdb7p,T 增加浓度
e~YJ8m!An']
+j*k i.d-@ 7、保护柱污染或失效 \(A3K6_ j
更换保护柱'o5u ynF pH-Ms%W

:y y'EE Tbd 8、色谱柱污染或失效,塔板数较低;L[ QZ1z]"Tl!R
更换同样类型的色谱柱。如果新柱子可以提供对称的色谱峰,则用强溶剂冲洗旧柱子。#zPf N#Y^!qF

2r9R(H;VB(iu 9、柱入口塌陷 O7](L(Ee
打开柱入口,填补塌陷或更换柱子6puvj8z8|'?
#u)?${'T5@)w;\X.J
10、呈现两个或多个未被完全分离的物质的峰 s5Ux/j{-I
选择其它类型的色谱柱以改善分离效果.Gp;K1JX(S0^
O(Fx.Q5}
11、柱温过低
e.J ~9MKq kj 提高柱温。除非特殊情况,温度不宜超过75℃
8],y;laJ)g3C y%ky
D^&wztC@.w-u#m 12、检测器时间常数太大 vH,eFS'l I
使用较小的时间常数0dH'A]3D#Ks-t

\ @'{_8m](nW%Y p、分离度降低8lRc s_,f
原及因解决方法v8?X"__ U#R*?

O@4r,AV 1、流动相污染或变质(引起保留时间变化)
ZpGo1jn)m#Z 重新配置流动相
,W7m X;Vj^
3hK N7cnh(f}5JBL 2、保护柱或分析柱阻塞图 z*J p!kDOZo3W
去掉保护柱进行分析。如果必要则更换保护柱。如果分析柱阻塞,可进行反冲。如果问题仍然存在色谱柱可能被强保留的污染物损坏,建议使用恰当的再生程序。如果问题仍然存在,进口可能阻塞了,更换入口处的筛板或更换色谱柱。 Er0c0K(Z:c
1p7S$Z)~$V3j
q、所有的峰面积都太小$i?h/rH#W3E:n
原及因解决方法,I*n/jd(|'q
WYNY-e
1、检测器衰减设定过高
w$_ ? [(jA{/U%L4a 减少衰减的设定
'Bo8`4{xl C6Tx S|:EjvRk/CE
2、检测器时间常数设定太大
g{ aoh\ 设定较小的时间常数
J/D}Q&RG&M`?
yXM)U0]v)K 3、进样量太少
G6w2j,K$G+B 增大进样量
zwcdl!L 0m2u"R@.f&{
4、记录仪连接不当 _(U&TH8a#m
使用正确的连接_ _3o{O
gY.es\dPU8S
r、所有的峰面积都太大
d;fP9U[/]\ydI(]+_ 原及因解决方法
-T ~A ^$@o6gP
7D6[~+b\m3F 1、检测器衰减设定过低
m7N!b)@ A 采取较大的衰减 z'G"F \bIn

*dkx7|N,~(?*D 2、进样过多
Gk,G|Tro` 减少进样量bzLA4fu:Xq
N6^}(l7HfK`8{.B
3、记录仪连接不正确 0f O }o4AL
正确连接记录仪

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