高效液相色谱常见问题分析与对策

高效液相色谱常见问题分析与对策
YYSC:x 液相色谱系统的许多问题都能在谱图上反映出来。其中有一些问题可以通过改变设备参数得到解决；而其他的问题必须通过修改操作程序来解决。对于色谱柱和流动相的正确选择是得到好的色谱图的关键。
M,YC'OP;n.G
!FR\#dFd7Ga%J @N J.m/ok
a、峰拖尾L)dO@}g2?}Q+M
原因及解决方法
y7U$^ qr'EH)R"jy5} 1、筛板阻塞
-HPEP9q3L a、反冲色谱柱  b、更换进口筛板 c、更换色谱柱3K g@{ oB2^

bm#d4V~]l&OJ 2、色谱柱塌陷 mtA YJ@m;s
重新填充色谱柱X6bh$Cz}

S4O2{gZ5\ 3、干扰峰 rR4i
q y~3S@+iw
a、使用更长的色谱柱 b、改变流动相或更换色谱柱
D{S2ckvy-n\F
8xt8Infu!Z 4、流动相PH选择错误
0un.zt%f.n1|x 调整PH值。对于碱性化合物，低PH值更有利于得到对称峰。 G&S3C\~,l U!f
rh-ov&stUd#zOT
]
5、样品与填料表面的溶化点发生反应
3p2w_U0pQ.pE a、加入离子对试剂或碱性挥发性修饰剂  b、更改色谱柱
2?(dD8h @b:Nm|
G%I-go'D/u b、峰前延
5P `1}(u+hZIzg+\ 原因及解决方法y?;b KLl9{1F&}

m/p.b!Z }^2j6` 1、柱温低 $X%}JQQ:BA9R%Bi
升高柱温|{.}^L1F1Zg7G
H+v+^[r Q~
2、样品溶剂选择不恰当 !rcE+p5N[
使用流动相作为样品溶剂\j$GX lC5l'r X

\5Nq.r H%wD EAS 3、样品过载 #AnT9N'a3n!Yb'^k^ J[
降低样品含量
ZV/uH6X,RZ1E 1~V;W4]gP0k A
4、色谱柱损坏 3Pi'@7~'Y?"evi Y
见a1、a2 X*uB]DNZ

@+a cf"F c、峰分叉
+@8_~%{$[Fp FR 原因及解决方法*z}9Ug5YB\ZV

+fxWg,Oi6O!I1Xfz8} 1、保护柱或分析柱污染
.{~m` t'p 取下保护柱再进行分析。如果必要更换保护柱。如果分析柱阻塞，拆下来清洗。如果问题仍然存在，可能是柱子被强保留物质污染，运用适当的再生措施。如果问题仍然存在，入口可能被阻塞，更换筛板或更换色谱柱。^/]7f mF
a%D,X/z

2~'~$|R pX0N 2、样品溶剂不溶于流动相 4rFd+m?c
改变样品溶剂。如果可能采取流动相作为样品溶剂。
kR RL#f[X
'WnPdY,V
ks!{ d、峰变形
Ycg.M8Nu"Jg 原因及解决方法
vW&Z:wY;\ GH\/Da/bKrC`0?|
1、样品过载
y|XL4X8CL%X j i 减少样品载量
1yp1P!Q}HaA
)YP|Q8i e、早出的峰变形
Re.K s8OE 原因及解决方法
M*cr&\
T7et\e+c/{ 5y
ubUw
1、样品溶剂选择不恰当
PL"fX-i,A@ a、减少进样体积   b、运用低极性样品溶剂&N+p YW&g$T
C#KV{$yGxDfg
f、早出的峰拖尾程度大于晚出的峰
`3Z Vet0@4v 原因及解决方法-\$XKm kC!K K3{'o

bH8Pn3c9|r
Y 1、柱外效应
"iGV E dTm^#s3@ a、调整系统连接（使用更短、内径更小的管路） b、使用小体积的流通池
g~2yVor -KQ-my9CX-q8\-p \_
g、K’增加时，脱尾更严重
'Z-IA^0b:Bo'UG 原因及解决方法
O!Ej*M2o1k_;r4S%yU
S!c"z C-k(PD]
g
1、二级保留效应，反相模式
SLmT%b5} kA a、加入三乙胺（或碱性样品） b、加入乙酸（或酸性样品） c、加入盐或缓冲剂（或离子化样品） d、更换一支柱子
(c@#v8SFg
w0vZqi-C p 2、二级保留效应，正相模式*n\B^@6HmP
a、加入三乙胺（或碱性样品） b、加入乙酸（或酸性样品） c、加入水（或多官能团化合物） d、试用另一种方法
]Jd%D.Z v K`E (b3H^!i6c
3、二级保留效应，离子对 F'C6h(R`$F,{L
加入三乙胺（或碱性样品）
%m aW4Sw_H"b
f$wvZI h、酸性或碱性化合物的峰拖尾8K}&tc+l+h snl
xKRZ
原及因解决方法 `U6`;imyF:v?,Gg
(PAY)s1a
1、缓冲不合适 2sM8x.r f Sw Q
a、使用浓度50-100mM的缓冲液 b、使用Pka等于流动相PH值的缓冲液
H8NO7m*w8` )O8U'jMX;S R-I1t A\"|
i、额外的峰
X3x1qbY9T
L 原及因解决方法
fd~)H`pHW.Ws
'K9aA-RO1G;Jy 1、样品中有其他组份
'E%Va[_MG.a6E 正常
xZA%Dv*si 5Q)U;sC*zI2C:tT}
2、前一次进样的洗脱峰
1tK%mp`1~{"K:z7wD a、增加运行时间或梯度斜率 b、提高流速
0H/c)WC(H)\{ 9Jn N/]xH-j ^*u
3、空位或鬼峰 %Ge,xQ-lD8[)X F
a、检查流动相是否纯净 b、使用流动相作为样品溶剂 c、减少进样体积
paZD u$gz
@f{:]~
` j、保留时间波动
mymh!Ej 原及因解决方法
!PqHw!yz
yhwB3Z)eK 1、温控不当
Y'N]s,` 调好柱温
[
?X] @;O] u6|(|x)_K|4UoV5N
2、流动相组分变化
W+gwX_*I
Gud FD"N*| 防止变化（蒸发、反应等）
*{$o"H~$`I-N kUybqk{)M
3、色谱柱没有平衡
1KO2J|,IR(A8rNtq 在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱
"]-B QN.S*pv
7tu5c7I7V*Pmb$t k、保留时间不断变化:NdlCjFKA s@0W
原及因解决方法
:T%j%K8Gpt.R3ASv /f@C;K%B:ET
1、流速变化 F iL)Q1DE%c j k
重新设定流速!Gkc MUL;A

ur+vNdA2X 2、泵中有气泡 rgM9A4rh
从泵中除去气泡
ob!LB9c*Gw
IU&h\!p4q^D C 3、流动相选择不恰当 #BY0Rp4v!Pl%t
a、更换合适的流动相 b、选择合适的混合流动相Pg^k+u
n'Qa ^F;M8p
l、基线漂移pF?+^l;u+u2u!i
原及因解决方法 N.sN"f2Fe

4s
C%T]*i 1、柱温波动。（即使是很小的温度变化都会引起基线的波动。通常影响示差检测器、电导检测器、较低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器。） 'F3V1v$~hpM
1、控制好柱子和流动相的温度，在检测器之前使用热交换器图"BC6K:Sq&}

*qO2pHsh8|2Y 2、流动相不均匀。（流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移。） D^L.t$U6S;\ j
使用HPLC级的溶剂，高纯度的盐和添加剂。流动相在使用前进行脱气，使用中使用氦气。
x N{*M4tB%h5n._ "w~"D2x JM
3、流通池被污染或有气体
+^XXZ4|&o |H 用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池。如有需要，可以用1N的硝酸。（不要用盐酸）
4gVI E%H GgW,YG
4、检测器出口阻塞。（高压造成流通池窗口破裂，产生噪音基线）
4[Fm@4gP| 取出阻塞物或更换管子。参考检测器手册更换流通池窗。{f@:F0_yP

#}{-~n!} 5、流动相配比不当或流速变化 ZM6X
|:g\0Y
更改配比或流速。为避免这个问题可定期检查流动相组成及流速。
NQ"_;s6_8my:N

Op2bQM(EHTH` 6、柱平衡慢，特别是流动相发生变化时 #F3x |R6K%Hz-J }vN
用中等强度的溶剂进行冲洗，更改流动相时，在分析前用10-20倍体积的新流动相对柱子进行冲洗。
3F a S0J9`4n i~4yP;H(F5p
7、流动相污染、变质或由低品质溶剂配成
O&^/?;`5K{:a 检查流动相的组成。使用高品质的化学试剂及HPLC级的溶剂#X(UPUe?f*d8~
uJ.otE}*C$|
8、样品中有强保留的物质（高K’值）以馒头峰样被洗脱出，从而表现出一个逐步升高的基线。
5C[d bO3Je3H 使用保护柱，如有必要，在进样之间或在分析过程中，定期用强溶剂冲洗柱子。!V?X2C(q

6BMt\sFH
i 9、使用循环溶剂，但检测器未调整。
S$i TdW p9p-|&Z(q)| d/G
重新设定基线。当检测器动力学范围发生变化时，使用新的流动相。I{RUW?

~8D2dSH0p 10、检测器没有设定在最大吸收波长处。
'MU_Gq
tnS 将波长调整至最大吸收波长处
t`)h3u;K5jA?Ur v+QM2De(n
m、基线噪音（规则的）'rf2d4`9T8X+t4j&g(cH
原及因解决方法/b&`2N'N*w7B!tU"U

3A_OR.?n};C%U^ 1、在流动相、检测器或泵中有空气
X4_2MR@v 流动相脱气。冲洗系统以除去检测器或泵中的空气。
5X|7L%`*pi9D7OJ
FH1xBSx
j1ar 2、漏液 d!o1e~F7@
见第三部分。检查管路接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要，更换泵密封。
G!]'d5K8D A
L([B
X/\,`\$u 3、流动相混合不完全
;J0DF?UY^B] 用手摇动使混合均匀或使用低粘度的溶剂
^UexA$k,v
Mn/pF!xy-CC3@ 4、温度影响（柱温过高，检测器未加热）
v
p[2pU'~2|wCo 减少差异或加上热交换器k,nR]#v2m;a

k X2g-H^3`:{$e 5、在同一条线上有其他电子设备 dd}fWjh\_
断开LC、检测器和记录仪，检查干扰是否来自于外部，加以更正。T-l0X2d/S+n+o;M
9I(UXeE
6、泵振动0?V,BWD^
在系统中加入脉冲阻尼器T2d`.[!ky3j

U,J5G4Ok1A{'~F n、基线噪音（不规则的）JJbPfu*P;d
原及因解决方法| G T+M i:e(OR;J
6FT.JI;J@&l
1、漏液
B1C8erZ;Q m5u.k6} 见第三部分。检查接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要，更换密封。检查流通池是否漏液。;Hxw*j"u.v
\ rKQA3Re6|
2、流动相污染、变质或由低质溶剂配成
&N'z0Zg @"E.`9X d
po 检查流动相的组成。Xa wee

!n q!Q,G~3Y? 3、流动相各溶剂不相溶
4RzQ)u:x 选择互溶的流动相b3o+j%N.`D5[+h#FY


fV4A.h zl%T(@ zu 4、检测器/记录仪电子元件的问题
9S)G'uOL%j;KF~Z 断开检测器和记录仪的电源，检查并更正。.W5a:aA-kfj/N-Y{

2}{#c-w+jX%a 5、系统内有气泡 ;Cnn,i3{)C
用强极性溶液清洗系统
!q_|`#gpVW4t
G 'J'u3Z:Hf8Df
6、检测器内有气泡 A5A H6G}H
清洗检测器，在检测器后面安装背景压力调节器
F4^2W}X J$wsAe:V o%`n
7、流通池污染（即使是极少的污染物也会产生噪音。）8c sX3~%l(\
用1N的硝酸（不能用磷酸）清洗流通池
`8V4aa$MrXC| 3n&JK};y4P
8、检测器灯能量不足 zb6F)o#N"Y(bD
更换灯E5_Mv5M5lb0j:Y
ErVQs+j#Qd
V
9、色谱柱填料流失或阻塞 4C)?gB6M'GE&_X9l
更换色谱柱(U1D4c@HC f$`

(C#r&DR;Cqv j 10、流动相混合不均匀或混合器工作不正常4l.c j!h,[LG`,yZ
维修或更换混合器，在流动相不走梯度时，建议不使用泵的混合装置7d-M]3E||1c
5L"sbEt1{@ S"Mz$O
o、宽峰J'r/mU!DN)]?-iYJ
原及因解决方法
Fd9H(uN?
:fp OT3M#yZ pJa 1、流动相组成变化
?_l-J~TS 重新制备新的流动相l Bi0aO kIj2SIG0F!L

%k.oME;_^)L(Lo\ 2、流动相流速太低U$eOU1I0D
调节流速
RKK{:p/}6^H0Mk L [ Z$f[ [+]
3、漏液（特别是在柱子和检测器之间）
N,HGEC-t1z;c 见section 3。检查接头是否松动、泵是否漏液、是否有盐析出以及不正常的噪音。如果必要更换密封。
%N}6KK
i4yBjI %@ yW'vs's
4、检测器设定不正确
{ijXYOo2W 调整设定
y N7T]ua6y e\A4Do
5、柱外效应影响
{-C)y$Msm3{:P a、柱子过载 b、检测器对反应时间或池体积响应过大  c、柱子与检测器之间的管路太长或管路内径太大  d、记录仪响应时间太长
g%qSu/|)x&m4Q 解决方法： a、 小体积进样（例如：10ul而不是100ul）以1：10或1：100的比例稀释样品  b、减少响应时间或使用更小的流通池  c、使用内径为0.007-0.01的短管路  d、减少响应时间?7~kVf&C&NF
Ocs3S,Qo7W4e,g
6、缓冲液浓度太低 s
L7g+IF#JJX_$c
增加浓度+{"zM$k.L9z V
)r(G tk3oF!j
7、保护柱污染或失效
$_!Efa.{Ho[r"x[Y 更换保护柱
2eZlTrK O$yX,M{oUpE"o
8、色谱柱污染或失效，塔板数较低
)Pg;Dr#T8Q1C|5lD 更换同样类型的色谱柱。如果新柱子可以提供对称的色谱峰，则用强溶剂冲洗旧柱子。
+WE7V|D$l5y oR"H }A\ d8d7r p
9、柱入口塌陷 +d.sZkMl#D
打开柱入口，填补塌陷或更换柱子[(X4E9L(bq~V

k$I5YY"wY)}E.g 10、呈现两个或多个未被完全分离的物质的峰 m!hIu$z(Vs~#t/};q E
选择其它类型的色谱柱以改善分离效果;j%G4qo1gC8k,F

7c%l N/U!zj&V2wX[ 11、柱温过低 f/h6rJGz(\s
提高柱温。除非特殊情况，温度不宜超过75℃
J onom @j-F sy:E+XC;YH
\
12、检测器时间常数太大
plhqXF0O9D!p!v 使用较小的时间常数
']kQ ShV(o%C)] uD0v{8q~|CwWb
p、分离度降低+As;@0E;V$T#Bz
原及因解决方法
qXgH
? a@)cj"? mFw
1、流动相污染或变质（引起保留时间变化） U3cwbaU1D7{ `
重新配置流动相
i)f1dk:auD
lFJ(_?+w 2、保护柱或分析柱阻塞图 ,A@2aFAhv*T$R{
去掉保护柱进行分析。如果必要则更换保护柱。如果分析柱阻塞，可进行反冲。如果问题仍然存在色谱柱可能被强保留的污染物损坏，建议使用恰当的再生程序。如果问题仍然存在，进口可能阻塞了，更换入口处的筛板或更换色谱柱。
4QD)E%g8x2fb
Q&~ Y4?s{d c q、所有的峰面积都太小
y%joKB/O'a$o{8` 原及因解决方法
LFx3I_C{G!G/WkDB pm-D.~?L7pU;G
1、检测器衰减设定过高 `:B6MnpO n*[9V
减少衰减的设定2Eq?5N)Qi#DRu
s8R.G/x.h(K Y+RY s
2、检测器时间常数设定太大zv4w R |
设定较小的时间常数\#zsoK9H"v*||G6O
4Kc?1Gx#J;^)d1^dGa
3、进样量太少
Au3q&y&xkK 增大进样量
V5H;jb:^
OL 9y3D9_CZ
4、记录仪连接不当
C2B9AO"P|x~9c 使用正确的连接
6n9u'xg8_2e
%@4F(`1e,m E;V~ r、所有的峰面积都太大
NM^Q.NSS9Q:Z&m 原及因解决方法
n$bBx-t+D7M}c 6b)DW!V E*V*D
1、检测器衰减设定过低 \C4y NT
采取较大的衰减
^b.SeOu"C5?
-}Nb2At!Yq 2、进样过多
7P4DM_g\TN 减少进样量!f.]1A`H#A5k?
ut?P3~,j
3、记录仪连接不正确
/xR4[(]XP_ 正确连接记录仪