各种层析法介绍

反相层析X~\} x"hy,qyj:H
反相层析（RPC）利用非极性的反相介质为固定相，极性有机溶剂的水溶液为流动相，根据溶质极性（疏水性）的差别进行溶质分离纯化的洗脱层析法。与疏水层析一样，反相层析中溶质亦通过疏水性相互作用分配于固定相表面。但是反相层析固定相表面完全被非极性基团所覆盖，表现强烈的疏水性，因此，必须采用极性有机溶剂（如甲醇、乙腈等）或其水溶液进行溶质的洗脱分离。
wH|u/a 溶质在反相介质上的分配系数取决于溶质的疏水性，一般疏水性越大，分配系数越大。例如，烃类化合物的分配系数与其分子所含的碳原子数成正比。当固定相一定时，可通过调节流动相的组成调整溶质的分配系数。流动相的极性越大，溶质的分配系数越大。因此反相层析多采用降低流动相极性（含水量）的线性梯度洗脱法。o)UTdz.I\)U
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反相层析以微粒多孔硅胶为基质，用硅烷化试剂与硅胶表面的硅醇基反应，生成共价键的单分子膜。硅烷化反应式为：                                     R1                            R1          ∣                       ∣               ∣          ∣      —Si—OH  +  Cl—Si—R  →  —Si—O—Si—R          ∣                       ∣               ∣          ∣                                     R2                             R2       （硅胶） （硅烷化试剂）     （反相介质）硅烷化试剂中的R1和R2多为甲基，R为C4、C8、C18烷基或苯基，其中利用C18硅烷化试剂制备的反相介质最多，通称ODS（Octadecyl silica），其次是C8和C4。-r.j/d TC/X"`

`([GELA@ 作为流动相的有机溶剂主要是乙腈、异丙醇和四氢呋喃等。乙腈由于粘度低，和水组成的二元流动相对多肽和蛋白质的溶解度高，被广泛应用。洗脱强度次序为：乙腈<乙醇<丙醇<异丙醇<四氢呋喃。d(}yv\PAC
流动相中离子对试剂分无机酸和有机酸两种。无机酸通常有磷酸、盐酸和高氯酸，其作用主要是抑制硅醇基离子化，增加蛋白质的亲水性，伴随着蛋白质极性的增加，降低了在层析柱上的保留时间。有机酸以三氟乙酸（TFA）和七氟丁酸（HFBA）应用比较多，虽然其作用也是阻止硅醇基的离子化，但它增加了蛋白质的疏水性。三氟乙酸是弱的疏水离子对试剂；七氟丁酸是较强的疏水离子对试剂，由于疏水性增强，在层析柱上的保留值也增加，从而提高了分离度。
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k$He$c T1w!LzHp\ 疏水层析与反相层析的区别&x!Fd:t:V:`%\
                            疏水层析               反相层析
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-r-p'J5W Bm2|rT~ 固定相        有机聚合物                           硅胶键合相                     大孔硅胶键合相                   上接C4、C8、苯基、C18、C22                     上接苯基、戊基、丁基、
jl M#]i0^e                          丙基、羟丙基、乙基、
5O2K`xzDJuH!~,u                          甲基、聚乙二醇`{+w#No!_.fv%_H
流动相                 pH6-8的盐溶液                       酸性低离子强度水溶液                     降浓度洗脱                           加入异丙醇、乙腈或甲醇4M'E J+K {?
蛋白稳定性        蛋白质变性的可能性小         蛋白质易变性
fW2l+E9_Zzn 离子对模型认为，试样离子首先在流动相中与离子对试剂的反离子生成不荷电的疏水性离子对，然后溶解或吸附于非极性固定相上。离子对试剂的烷基碳链越长，生成的离子对与固定相的亲和力越大，因此组分的保留值也越大。
d9S*B:x'a4AfKn 以分离碱类物质为例，说明离子对模型                          流动相          ┊           固定相                  pKb1                      ┊    B + H+ ═══ BH+             ┊                              +               ┊                  pKb2                      ┊ RSO3Na═══ RSO3- + Na+ ┊                             ‖               ┊                             ‖pKb3        ┊                             ‖               ┊                     [BH+ · RSO3-] ═══ [BH+ · RSO3-]                      中性离子对
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HZ5i_\7f%N （1）分析碱类物质用离子对试剂PICB，常用正烷基磺酸盐类，反应如下：R─NH3+（流动相pH3-3.5） + PICB- = [RNH3+  PICB-]（2）分析酸类物质用离子对试剂PICA，常用季铵盐类，反应如下：R─COO-（流动相pH≈7.5） + PICA+ = [RCOO-  PICB+]
QmV'\,ygD9P } 通常所选用的离子对试剂的电荷应与被分离样品的电荷相反。分析碱类或带正电荷的物质，常用带负电荷的烷基磺酸盐或硫酸盐作为离子对试剂；分析酸类或带负电荷的物质，常用带正电荷的季铵盐作为离子对试剂。
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常用的离子对试剂及其主要应用：—————————————————————————————                                  离子对试剂                             主要应用对象    —————————————————————————————季铵盐（如四甲胺、四丁             强酸、弱酸、磺酸染料、羧酸、 胺、十六烷基三甲胺等）             氢化可的松及其盐类    —————————————————————————————叔胺（如三辛胺）                         磺酸盐、羧酸    —————————————————————————————烷基磺酸盐（如戊烷-、己烷-、   强碱、弱碱、儿茶酚胺、肽、 庚烷-、樟脑磺酸盐）                    鸦片碱、烟酸、烟酸胺等    —————————————————————————————高氯酸                                             可与碱性物质（如有机胺、甲状烷基硫酸盐（如辛烷-、癸烷-、   腺碘代氨基酸、肽等）生成稳定十二烷基硫酸盐）                  的离子对，与烷基磺酸盐相似，                                                          选择性有所不同-ilti)?f
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离子对层析法适用于有机酸、碱、盐的分离，以及用离子交换层析法无法分离的离子和非离子混合物的分离。在药物分析中，离子对层析法的应用非常广泛，如生物碱、有机酸、磺胺类药物、某些抗生素与维生素等的分析。在许多药物分析课题中，反相离子对层析法可以取代离子交换层析法，但离子对试剂价格较贵是其缺点。

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