中药材 第5期
HPLC-ELSD法考察不同产地女贞子中齐墩果酸与熊果酸的含量
摘要：目的：用HPLC-ELSD法考察不同产地女贞子中齐墩果酸与熊果酸的含量。方法：采用HPLC-ELSD法。色谱柱：Lichrospher C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：甲醇-0.5%醋酸铵溶液（90：10）；Alltech ELSD 2000（蒸发光散射检测器）。结果：在此色谱条件下，齐墩果酸与熊果酸峰完全达到基线分离（R>1.9）。十批不同产地女贞子中齐墩果酸含量均在0.7%以上，熊果酸含量均在0.1%以上。齐墩果酸含量测定的线性范围为0.76μg～11.4μg（r=0.9985，n=6），平均加样回收率为97.38%，RSD为1.9%；熊果酸含量测定的线性范围为0.118μg～1.77μg（r=0.9996，n=6），平均加样回收率为96.10%，RSD为1.7%。结论：本法简便、准确、结果可靠、重现性好，为建立女贞子和其它同含此二种成分的中药材（如山楂、山茱萸等）的质量控制方法提供了参考。
关键词：女贞子；齐墩果酸；熊果酸；HPLC-ELSD
女贞子含女贞子苷、洋橄榄苦苷、齐墩果酸、乙酰齐墩果酸、熊果酸、乙酰熊果酸、4-羟基-β-苯乙基-β-D-葡萄糖苷、桦木醇、甘露醇、棕榈酸、脂肪酸、苹果酸等，具有滋补肝肾、明目乌发的功效；药理研究显示女贞子具有保肝、抑瘤、升白、生血、抗衰老、抗变异、增强机体免疫功能等作用，而其中齐墩果酸与熊果酸的存在是其具有抗变异活性的主要原因。《中国药典2000年版一部》对女贞子中的齐墩果酸采用薄层色谱法进行定量控制，但因女贞子中还含有熊果酸，二者同属三萜酸，性质与化学结构较为相似，TLC法定量时，二者相互干扰。齐墩果酸与熊果酸在紫外区同属末端吸收，采用HPLC-UV法测定效果不太理想。本文首次采用ELSD（蒸发光散射检测器），用高效液相色谱法对二成分进行同时测定，并进行了方法学考察，获得了满意的结果。
1 仪器与试剂、试药
1.1 仪器 Waters Alliance HT型高效液相色谱仪，Alltech ELSD 2000型蒸发光散射检测器。
1.2 试剂与试药 甲醇（色谱纯，Tedia公司，美国），水（超纯水），醋酸铵（分析纯，西安化学试剂厂生产）。齐墩果酸与熊果酸对照品（均由中检所提供，批号分别为110709-200304、110742-200313），十批试验用女贞子，经陕西省药品检验所中药室郝武常主任鉴定均为木犀科植物女贞Ligustrum lucidum Ait.的干燥成熟果实。
2 方法
2.1 对照品溶液的制备 精密称取齐墩果酸与熊果酸对照品适量，加甲醇制成每1ml分别含0.4mg与0.06mg的混合溶液，摇匀，即得。
2.2 供试品溶液的制备 取本品粉碎，精密称取1.0g，置50ml具塞锥形瓶中，精密加甲醇25ml，称重，超声处理30分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。
2.3 色谱条件：色谱柱：Lichrospher C18柱（4.6mm×250mm,5μm）（江苏汉邦公司）；流动相：甲醇-0.5%醋酸铵溶液（90：10）；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；ELSD漂移管温度
：85℃，雾化气体为高纯氮气（99.999%）：2.0L/min；放大系数（Gain）：4；撞击器（Impactor）：off。在此色谱条件下，齐墩果酸与熊果酸峰完全达到基线分离（R>1.9），理论板数以齐墩果酸峰计在10000以上。
3 结果
3.1 线性关系考察 取齐墩果酸与熊果酸对照品，加甲醇制成每1ml分别含0.38mg的齐墩果酸和0.059mg熊果酸的混合溶液，精密吸取2μl、5μl、10μl、15μl、20μl、30μl进样，测定。以进样量（μg）的自然对数值为纵坐标、峰面积积分值的自然对数值为横坐标，采用双自然对数法进行线性回归。结果齐墩果酸线性回归方程为Y=0.7998X-4.6417（r=0.9985），线性范围为0.76～11.4µg；熊果酸线性回归方程为Y=0.7021X-4.3065（r=0.9992），线性范围为0.118～1.77µg。
3.2 精密度试验 精密吸取同一对照品溶液10μl,重复进样6次，测得齐墩果酸峰面积平均值为2967880（RSD=2.1%），熊果酸峰面积平均值为605568（RSD=1.9%）。
3.3 稳定性试验 取同一供试品溶液，精密吸取10μl，每隔2小时测定一次，计算齐墩果酸峰面积平均值为5013654（RSD=2.2%），熊果酸峰面积平均值为1020135（RSD=2.0%）。说明供试品溶液在24小时之内基本稳定。
3.4 重复性试验 取同一样品（广西南宁产）6份，分别按2.2项下方法操作测定。结果每1g样品中，齐墩果酸平均含量为9.95mg（RSD=1.7%），熊果酸平均含量为1.45mg（RSD=1.8%）。
3.5 加样回收率试验 取3.4项下已知含量的供试品6份，各精密加入齐墩果酸对照品与熊果酸对照品一定量，照供试品溶液的制备法进行处理，测定其中齐墩果酸与熊果酸的含量。结果齐墩果酸的平均加样回收率为97.38%（RSD=1.9%）, 熊果酸的平均加样回收率为96.10%（RSD=1.7%）。
3.6 样品含量测定 取不同产地的女贞子样品，用本实验方法测定其中齐墩果酸与熊果酸的含量。结果见表1
4 讨论
4.1 供试品提取溶剂与提取方法的选择 采用氯仿、无水乙醇、甲醇、乙醚四种溶剂，对同一女贞子样品进行索氏提取处理。结果发现氯仿、无水乙醇、乙醚提取效果相当，而以甲醇作提取溶剂，齐墩果酸与熊果酸得率均略高；氯仿提取液蒸干用甲醇溶解后色谱图上齐墩果酸峰前有一明显干扰测定的色谱峰，经石油醚（30～60℃）脱脂处理后该色谱峰消失，而甲醇提取液色谱图杂质色谱峰较少，对齐墩果酸与熊果酸峰测定亦无干扰。选择好甲醇作溶剂后，对比索氏提取与超声处理两种提取方法，结果二法所测齐墩果酸与熊果酸的含量未见差异，为便于操作，选择超声处理作为供试品处理方法。
4.2 ELSD作为一种质量型检测器，在比较宽的范围内，峰面积（A）与样品的质量（m）成双对数线性关系。定量分析时，为得到精确的数据，应用标准品做校正曲线对实验条件进行校正或直接用标准曲线法定量。本试验采用如下方法：精密吸取对照品溶液5μl、10μl、20μl及供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。对照品峰面积积分值与进样量（μg）均取自然对数后列出线性方程，将供试品峰面积积分值取对数后代入方程求得进样量（μg）的自然对数，再换算成供试品的含量即可。
4.3 方法中确定的ELSD参数，是经反复试验后得出的最佳仪器参数。雾化气体流速及漂移管温度是影响ELSD检测的2个重要可调节参数。雾化气体流速太低，会形成大量液滴，导致尖峰信号或噪音信号；相反，流速太高时微滴量会下降导致信号响应降低。漂移管温度太低，溶剂挥发不够完全；太高，则会由于分析样品部分挥发，导致颗粒量下降而使检测器响应下降。实验室操作时需注意调节。
4.4 曾对甲醇-水（90：10）、乙腈-水（75：25）、甲醇-0.5%醋酸铵溶液（90：10）、乙腈-甲醇-水（64：20：16）等不同流动相做过对比研究，结果发现以甲醇-0.5%醋酸铵溶液（90：10）作流动相即可得到满意的色谱峰性，齐墩果酸与熊果酸峰的分离度也较高。
4.5 实验中所用女贞子来自不同产地，加上采集时间、炮制方法等各不相同（主要为直接晒干或蒸后晒干），故其中齐墩果酸与熊果酸含量均有差异。但总体来说，齐墩果酸含量均高于药典规定限度（0.60%），熊果酸含量均在0.1%以上。与以前文献报道女贞子中齐墩果酸和熊果酸的含量测定结果基本一致[2] [3] [4]。[p:1][p:1][p:5][/hide]
熊果酸相关资料：
http://www.plantextra.com/bbs/se ... mp;searchsubmit=yes
| 帮助
